老坛酸菜是一种受欢迎的中国传统发酵蔬菜，在工业上经过４次发酵生产。然而，４个生产发酵阶段的老坛酸菜风味品质差异及其原因尚不清楚。近日，南昌大学食品学院熊涛教授团队在《Food Chemistry》上发表了新的研究成果，确定了老坛酸菜风味形成的核心微生物和不同发酵周期的差异特征风味化合物以及微生物演替的驱动因素，揭示了关键风味化合物的代谢途径，以及与核心微生物的关系，为研究老坛酸菜发酵过程中风味品质的提升提供了一个新的视角。
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研究背景
作为一种传统发酵蔬菜，老坛酸菜因其风味独特而广受消费者欢迎，目前的研究大多集中在单轮实验室规模的发酵蔬菜中微生物群落和风味属性之间的相关性上，很少有研究关注工业规模发酵蔬菜多轮发酵过程中微生物的演替和风味品质的差异。此外，对蔬菜发酵过程中微生物群落聚集过程的研究也较少。因此，本研究对工业规模(500 kg/批)老坛酸菜4轮发酵的风味品质和菌群进行了研究，旨在确定影响风味形成的核心微生物群、化合物，及其相互作用机制，进一步重点筛选具有优良风味调节能力的发酵菌株来提高老坛酸菜的风味品质。
实验设计
将新鲜腌雪里蕻加盐水和各种辅料室温（约20℃-25℃）发酵一个月作为第一次发酵；取第一次发酵物加入老盐水（盐度6%-8%）放入坛子进行第二次发酵，重复第二次发酵的步骤两次，作为第3次和第4次发酵。每一次发酵结束后，选择5个特定罐，从每个罐的上、中、底层采集样品，充分混合作为代表样品（n=5）。
研究结果
1. 老坛酸菜发酵4次发酵过程中发酵参数的动态变化
对老坛酸菜不同发酵周期样品的发酵参数进行检测，发现不同发酵周期之间存在显著差异（图1A-D）。pH在第1 ~ 3次发酵时显著升高，在第4次发酵时显著降低；老坛酸菜的可滴定酸度（TA）随着发酵次数的增加而显著升高；盐分在第1次发酵样品中含量最高，然后随着发酵次数的增加而显著下降；亚硝酸盐含量从第1次到第2次发酵过程中显著增加，从第2次到第4次发酵时显著降低，且在第2次发酵时达到峰值（4.57 mg/kg），值得注意的是老坛酸菜在各次发酵样品中的亚硝酸盐浓度均低于国家限量标准（20 mg/kg）。
图1 老坛酸菜四次发酵过程中发酵参数和有机酸的动态变化
２. 老坛酸菜发酵4次发酵样品的口感差异
在4次老坛酸菜发酵过程中，共检出4种有机酸和１７种游离氨基酸，且具有显著差异，其中草酸、乳酸和乙酸含量随着发酵次数的增加而逐渐积累，而苹果酸含量呈先上升后下降的趋势，且在第3次发酵时达到峰值（图1G-H）。总氨基酸、鲜味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸含量均随发酵次数的增加而增加。在不同发酵周期中，赖氨酸（Lys）含量最高，是除第1轮发酵外各发酵轮中唯一具有风味活性的氨基酸，且其含量随着发酵次数的增加而不断增加。综上，不同发酵周期的老坛酸菜口感品质的差异主要归因于草酸、乙酸、乳酸、苹果酸和赖氨酸含量的变化。
表1老坛酸菜在四次发酵过程中17种游离氨基酸的动态变化及其味觉活力值分析
３、老坛酸菜4次发酵过程中香气的变化
采用GC-QTOF/MS联用技术对不同发酵次数老坛酸菜的挥发性代谢产物进行了分析，共检出76种挥发性化合物，包括22种萜类化合物、13种硫化物、11种烃类化合物、9种酯类化合物、6种氮化物、5种醇类化合物、4种异硫氰酸酯类化合物、3种酮类化合物和3种其他化合物。此外，第3次发酵样品中萜类化合物的含量低于其他发酵轮，而异硫氰酸酯的浓度则相反。各次发酵样品中所有挥发性风味代谢物的主成分分析（PCA分析）和HCA得分图以及偏最小二乘法分析（PLS-DA）结果表明第2轮和第3轮的风味谱更为相似。此外，共有31种代谢物（VIP>1，p<0.05）被鉴定为香气差异化合物，且这些差异化合物在不同发酵阶分布不同，它们在第2、3次发酵样品中分布更相似。其中，萜类化合物主要是在第1次和第4次发酵中富集。上述结果表明，31种挥发性风味物质含量的差异导致不同发酵周期老坛酸菜香气品质的差异。
图2 老坛酸菜4次发酵过程中香气的变化
４、老坛酸菜形成过程中微生物群落的演替
对不同发酵周期的老坛酸菜样品微生物多样性进行研究，发现发酵周期不同，其微生物群落结构也不同。第1次发酵样品的物种丰富度和均匀度均显著高于第4次发酵样品，且随发酵次数的增加而逐渐降低。在门的水平上，4次发酵样品中的优势菌均为厚壁菌门微生物，但在属水平和种水平上，各发酵样品中的优势菌各不相同，其含量变化趋势也不一致。Lefse分析结果发现，不同发酵周期样品具有不同的差异标志物。
图3 老坛酸菜在4次发酵过程中微生物群落的演替
５、老坛酸菜4次发酵样品中的微生物群落组合和共现模式
对老坛酸菜4次发酵过程中影响微生物群落聚集的关键非生物因素进行方差分解分析（VPA分析），发现有机酸（草酸、苹果酸、乳酸和乙酸）和发酵参数(pH、TA、盐分和亚硝酸盐)与微生物群落结构显著相关，其中有机酸是影响微生物群落组合的主要驱动力。通过构建4次发酵过程中的微生物共生网络，发现各次发酵样品的优势菌群通常属于同一模块：第2、3次发酵样品的优势菌群主要属于模块1，第1次发酵样品的优势菌群主要属于模块2，而第4次发酵样品的优势菌群主要属于模块3。对４次发酵样品中的微生物关键种进行Zi-Pi分析，共筛选得到４个connectors和１个module hub。
图4 老坛酸菜4次发酵样品中的微生物群落组合和共现模式
６、不同风味形成的核心微生物和潜在代谢网络
对老坛酸菜４次发酵样品发微生物种群与其风味特征进行Spearman相关分析，发现18株细菌与35种风味代谢物相关，其中乳杆菌属、那慕尔促生乳杆菌、耐酸乳杆菌、植物乳植物杆菌、消化伴生乳杆菌、发酵粘液乳杆菌和棒状腐败乳杆菌为差异风味形成的核心微生物。此外，基于KEGG数据库，通过PICuRST2的功能预测，重构了差异特征风味化合物的潜在代谢途径，结果表明赖氨酸和L-亮氨酸主要由原料中的蛋白质水解产生。
图5 关键风味形成的核心微生物和潜在的代谢网络
研究结论
对老坛酸菜4种发酵样品中风味代谢产物和微生物菌群的动态变化进行研究，获得以下研究结论：
（１）老坛酸菜样品中有机酸的含量随着发酵次数的增加而不断积累，引起老坛酸菜酸味过酸；
（２）31种挥发性风味物质的含量在各次发酵样品具有一定的差异，其中第2次和第3次发酵样品的香气成分接近；
（３）老坛酸菜在发酵过程中为区别风味形成的核心微生物有乳杆菌属、那慕尔促生乳杆菌、耐酸乳杆菌、植物乳植物杆菌、消化伴生乳杆菌、发酵粘液乳杆菌和棒状腐败乳杆菌。
原文引用：
Xiong S, Xu X, Du T, et al. Organic acids drove the microbiota succession and consequently altered the flavor quality of Laotan Suancai across fermentation rounds: Insights from the microbiome and metabolome. Food Chemistry. 2024 450:139335. DOI: 10.1016/j.foodchem.2024.139335.
原文链接：
DOI: 10.1016/j.foodchem.2024.139335.
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